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BNA3 指的是 “2',4'-BNANC（2'-O,4'-氨基乙烯桥连核酸）”，其包含 2',4'-BNANC[NH]、2',4'-BNANC[NMe] 和 2',4'-BNANC[NBn] 三种版本。目前我们可合成的 BNA 为 2',4'-BNANC[NMe] 版本（结构如下）。2',4'-BNANC[NH] 版本也将在数周内可供使用。
BNA 寡核苷酸（BNA3）可以采用 100% BNA3 碱基，也可以采用 BNA/DNA、BNA/RNA 或其他嵌合设计进行合成。然而，只有长度为 7–10 mer 的寡核苷酸可以完全由 BNA 组成。如果序列更长，100% BNA 的寡核苷酸可能会与自身强烈结合（自互补），而不是与目标序列结合。
因此，对于 长度超过 15 mer 的寡核苷酸，我们建议随着序列长度增加逐步降低 BNA 含量，具体如下：
如果确实需要更长的序列，我们可以按照客户现有设计合成 嵌合寡核苷酸：混合 BNA 碱基、DNA 碱基、硫代磷酸酯修饰，并在 BNA 两端保留磷酸二酯键连接的 BNA。这是我们能够合成更长序列的唯一方式。
BNA 引入位置建议
- BNA 应引入在需要提高特异性和区分能力的位置（例如等位基因特异性 PCR 的 3' 端，或 SNP 杂交探针的突变位点）。
- 避免连续超过 4 个 BNA 碱基。多个连续 BNA 会显著增强杂交强度。
- 典型 18 mer 引物中 BNA 数量不应超过 8 个。
- 每个 BNA 碱基可使 Tm 升高约 2–4°C。
- 避免在 3' 端附近使用 BNA 块状结构。
- GC 含量保持在 30–60%。
- 避免超过 3 个连续 G 或 C（DNA 或 BNA）。
- 引物对的 Tm 应尽量接近。
体内基因敲低（In vivo Knockdown）
- 建议使用 硫代磷酸酯骨架（phosphorothioate）。
- 可考虑使用 胆固醇修饰寡核苷酸或 细胞穿透肽（CPP）以提高细胞摄取效率。
Clamp Oligo 设计
Clamp 寡核苷酸中 BNA 修饰比例取决于：
- BNA-NC 类似物类型
- 寡核苷酸长度
- GC%
- 突变类型
- Tm 值等
一般建议使用 >50 mer 或 ≥15 mer 的 DNA 寡核苷酸，并使用磷酸化、Spacer 或双脱氧末端修饰来阻止引物延伸。
SNP 微阵列分型（Microarray）设计指南
以下为用于 SNP 芯片分型的 BNA 寡核苷酸设计建议（同时适用所有通用设计原则）：
- 捕获探针长度约 12 bp。
- 在 SNP 位点直接引入 2–3 个 BNA 碱基。
- 错配位置可灵活调整，但将 SNP 放在 3' 或 5' 端或距离末端 1 个碱基处可能降低区分能力。
- 推荐 Tm 约 65°C。
- 回文序列中不应放置 BNA（GC 配对禁止，AT 相对不敏感）。
PCR 引物设计指南
- BNA 应放置在需要提高特异性的区域（如 3' 端或 SNP 位点）。
- 避免连续超过 4 个 BNA。
- 建议从 5' 端开始加入 BNA（提高 5' 端退火温度，避免 3' 端非特异性退火）。
- 避免 BNA 自互补或与其他 BNA 寡核苷酸互补（BNA–BNA 结合非常强）。
- 18 mer 引物中 BNA 不超过 8 个。
- 每个 BNA 增加 Tm 2–4°C。
- 避免在 3' 端附近使用 BNA 块。
- GC 含量保持 30–60%。
- 避免连续超过 3 个 G（DNA 或 BNA）。
- 引物对 Tm 应接近。
等位基因特异性 PCR（AS-PCR）设计指南
- 在 3' 端或 3'-1 位置放置 1 个 BNA，并使其对应突变位点。
- 遵循通用设计原则。
实时荧光 qPCR 探针设计指南
- 探针 3' 端需使用 PO₄、NH₂ 或阻断核苷酸封闭，防止延伸。
- 探针 Tm 应比前向引物高 10°C；若用于单碱基突变检测，Tm 差应为 7°C。
- PCR 引物典型 Tm：58–60°C。
- 标记探针典型 Tm：65–70°C（略低于延伸温度）。
- BNA 探针最佳长度：15–18 nt（比 DNA 探针短 5–8 nt）。
- 通过 BNA 替换保持与对应 DNA 探针相同的 Tm。
- 在探针中央区域每隔 3 个碱基替换 1 个 BNA，通常需要 4–6 个 BNA。
- 避免连续超过 3 个 G（DNA 或 BNA）。
- 单碱基突变检测时，将突变位点置于探针中央，并在该位置替换 1 个 BNA。
- 避免参与二级结构形成的 BNA 替换。
- 探针应尽量靠近前向引物。
- 避免荧光基团 5' 端紧邻 G。
- 选择 G 含量最低的链作为探针。
- 避免长串相同碱基，尤其是 G。
- GC 含量保持 30–60%。
我们提供的所有荧光染料均可与含 BNA 的探针偶联（FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、CY3、CY3.5、Texas Red、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa 系列等）。