干货分享：肽核酸（PNA） 端粒探针 FISH（荧光原位杂交）

原则上，荧光原位杂交（FISH）能够提供个别染色体端粒长度的信息。直接标记的寡核苷酸探针是这种分析的理想选择，它们体积小、渗透性能好、单链且无需变性，同时合成过程可控。然而，寡核苷酸杂交用于端粒重复序列的效率还不够高，主要用于对各种物种染色体上的 TTAGGG 重复序列进行定性研究。

最近，研究发现肽核酸（PNA）寡核苷酸探针能够与互补的寡核苷酸序列杂交，并且生成的双链比 DNA/DNA 或 DNA/RNA 双链更稳定。在 PNA 中，常规 DNA 和 RNA 寡核苷酸的带电磷酸脱氧核糖主链被由重复的 N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的无电荷主链所取代，且通过肽键连接。与 DNA 寡核苷酸相比，PNA 寡聚物显示出更高的序列特异性、更高的稳定性、更好的重复性以及更低的背景信号。由于 PNA/DNA 双链的熔解温度 (Tm) 更高，因此广泛使用短的 (18-mer) 端粒 PNA (CCCTAA)。

在开始之前要做的事情

I. 准备端粒PNA探针

1. 在打开管子之前，将其离心，以收集底部的冷冻干燥PNA探针。
2. 加入甲酰胺以获得PNA探针的储备溶液。
3. 将储备溶液稀释在PNA杂交缓冲液中，最终浓度为200nM。注意：将PNA探针溶液储存在4°C的黑暗中

II. 溶液准备

1. 杂交缓冲液：

• 20 mM Na₂HPO₄，pH 7.4
• 20 mM Tris，pH 7.4
• 60%甲酰胺
• 2倍SSC
• 0.1 μg/ml鲑鱼精DNA

1. RNase A溶液：

• 2倍SSC中100 μg/ml RNase A

1. 胃蛋白酶0.005%溶液：

• 50 ml 0.01 M HCl中的50 μl 5%胃蛋白酶储备液注意：现配现用！使用前加热至45°C。

1. 洗涤溶液：

• 2倍SSC/0.1% Tween-20

杂交和洗涤

I. 预处理

1. 按照推荐的特定细胞系程序准备载玻片并风干。
2. 将载玻片浸入PBS中15分钟。
3. 在37°C下在含4%甲醛的PBS中固定载玻片4分钟。
4. 在37°C下用PBS洗涤5分钟（重复2次）。
5. 在清洁的板上加入500μl RNase A溶液，将每个载玻片正面朝下放在RNase A溶液中，在37°C下放置1小时。注意：注意不要干燥。
6. 在2倍SSC中洗涤（重复3次），再用无水洗涤。
7. 将载玻片在37°C下浸入0.005%胃蛋白酶中4分钟。
8. 在37°C下用PBS洗涤3分钟（重复2次）。
9. 重复步骤3-4。
10. 在室温下用PBS洗涤5分钟。
11. 在冷乙醇系列中脱水载玻片（在70%、85%、100%中各1分钟）。
12. 在空气中晾干载玻片。

II. 杂交

1. 将载玻片放入预热至80°C的孵育器中加热5分钟。
2. 向每个载玻片的标记区域添加20μl PNA探针于杂交缓冲液中。注意：使用前将杂交缓冲液在90°C下加热5分钟。
3. 用18x18 mm盖玻片覆盖每个载玻片的标记区域。注意：小心避免干燥。
4. 在85°C下变性载玻片10分钟。注意：变性应在80°C至90°C之间进行。仔细检查孵育器的温度，变性温度低于75°C会严重影响结果。
5. 将载玻片置于室温暗处1小时。

III. 洗涤

1. 将载玻片浸入室温的洗涤溶液中，以去除盖玻片。
2. 在55-60°C下用洗涤溶液洗涤载玻片10分钟（重复2次）。注意：洗涤应在55-60°C下进行。
3. 在室温下用洗涤溶液洗涤载玻片1分钟。

IV. 复染

1. 在DAPI/2倍SSC中染色载玻片10分钟。
2. 在2倍SSC中洗涤载玻片2分钟。
3. 在1倍SSC中洗涤载玻片2分钟。
4. 在无水中洗涤载玻片2分钟。
5. 用离心机将载玻片晾干。
6. 向载玻片的目标区域添加一滴安装介质。
7. 覆盖盖玻片，使溶液均匀展开。避免气泡。
8. 使用适当的滤光片在荧光显微镜下观察染色载玻片。

V. 参考文献

1. Kentaro Taemura et al. 2005, Developmental Biology 281196-207.
2. Won-Woo Lee et al. 2002, Immunology 105, 458-465.
3. Heather Perry et al. 2001, Journal of Microbiological Methods 47, 281-292.
4. Caifu Chen et al. 1999, Mammalian Genome 10, 13-18.
5. M. Hultdin et al. 1998, Nucleic Acids Research 26(16), 3651-3656.
6. Peter M. Landsdorp et al. 1996, Human Molecular Genetics 5(5), 685-691.

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精选引用

想了解使用我们的PNA已发表的研究文献吗？

Exponential Increase in an Ionic Signal: A Dominant Role of the Space Charge Effect on the Outer Surface of Nanochannels

^{_{Anal. Chem. | 28 Sep 2021 | DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c03431}}

^{_{All single-stranded PNA sequences were purchased from SBS Genetech Co., Ltd. (Beijing, China).}}

Peptide Nucleic Acid-Functionalized Nanochannel Biosensor for the Highly Sensitive Detection of Tumor Exosomal MicroRNA

^{_{Anal. Chem. | 30 July 2021 | DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01898}}

^{_{PNA was synthesized by SBS Genetech Co. Ltd. (Beijing, China). Table S1 shows the above-mentioned oligonucleotide sequence.}}

Ultrasensitive Exosomal MicroRNA Detection with a Supercharged DNA Framework Nanolabel

^{_{Anal. Chem. | 2 April 2021 | DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00295}}

^{_{Thiolated PNA with a−(CH2)6− spacer at the 5′ end was synthesized and purified by SBS Genetech Co., Ltd. (Beijing, China). All the sequences are shown in Table S1.}}