体外转录（in vitro transcription，IVT）是用于产生CRISPR-Cas9基因编辑系统中sgRNA的经典方法。然而，IVT具有几个明显的缺点。首先，通过IVT合成sgRNA非常耗费时间，并且很难对sgRNA的质量进行把控。此外，使用IVT合成的sgRNA有可能将DNA或其他污染物引入细胞。
化学合成的sgRNA与IVT合成的sgRNA相比具有许多优点。首先，因为前者是通过化学反应合成的，所以这些sgRNA所需的制备时间更短。同时，化学合成的sgRNA也比IVT合成的sgRNA纯度更高，这使得其编辑效率和结果的一致性更高。化学合成的sgRNA还可以在特定的核苷酸残基处进行化学修饰以抵抗核酸外切酶和免疫降解，进一步提高编辑效率。所有这些因素使得化学合成sgRNA成为CRISPR编辑的更可靠选择。
因为化学合成的sgRNA比IVT合成的sgRNA质量更高且可以调控，所以前者可以根据不同的CRISPR实验去优化至最佳条件。本文章将逐步讲解如何优化化学合成的sgRNA。遵循这些步骤将确保您化学合成的sgRNA大幅优于IVT合成的sgRNA，增加您对实验结果的信心。
说明
· 为了获得最佳结果，我们建议使用与Cas9核酸酶复合的化学修饰的sgRNA作为核糖核蛋白（RNP）。然而，您也可以使用其他sgRNA/Cas9形式进行实验，包括未修饰的sgRNA，Cas9 mRNA或Cas9表达细胞。
· 所有优化和比较实验应在相同的细胞系或培养物中进行，并包括所有相关的阳性和阴性对照。
· 在比较时，确保IVT合成的sgRNA和化学合成的sgRNA具有相同的序列。
· 在优化细胞系中的摩尔比和RNP浓度后，我们建议对每个靶基因测试多个sgRNA，以确定哪些序列可以产生最高的编辑效率。
步骤1：优化sgRNA和Cas9的摩尔比
我们建议将sgRNA和Cas9预先复合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）来进行实验。使用RNP转染可以让您更好地控制sgRNA和Cas9的摩尔比，并保护sgRNA免于降解。确定特定细胞类型的最佳RNP的摩尔比非常重要，我们建议从1:1的摩尔浓度比（sgRNA: Cas9）开始测试。通过实验确定在您的细胞类型中产生最高编辑效率的sgRNA: Cas9摩尔比，并在以后的实验中保持这个比例。
步骤2：优化RNP浓度
一般来说，增加RNP的摩尔浓度会倾向于提高编辑效率。然而，随着RNP浓度继续增加，编辑效率将趋于平稳，并且可能具有潜在的细胞毒性。因此，通过进行剂量反应实验确定最佳RNP浓度非常重要。根据所使用的转染系统不同，最佳浓度可能会有所不同。我们建议在测试细胞系时RNP浓度范围保持在0.5μM-1μM，而原代细胞的RNP浓度范围为0.5μM-100μM（保持体积恒定）。
步骤3：对每个靶基因测试多个sgRNA
一旦确定了您的RNA最佳摩尔比和浓度，就需要比较多个sgRNA。因为并非所有sgRNA都有一样高的编辑效率，所以此步骤对于识别有效的sgRNA非常重要。同时，我们也建议同时测试具有化学修饰的sgRNA是否在您的细胞类型中产生更高的编辑效率。在原代细胞和干细胞中，经化学修饰的合成sgRNA通常有着更高的编辑效率。
小结
· 相对于IVT合成的sgRNA，化学合成的sgRNA在质量和编辑效率方面表现更加优异。
· 建议将CRISPR组分作为核糖核蛋白（RNPs）引入细胞。
· 当切换到使用化学合成的sgRNA时，有必要针对您的细胞类型重新优化CRISPR组分的摩尔比和RNP浓度。
· 测试化学修饰是否能提升您的细胞类型的编辑效率。
· 优化完成后，建议对每个靶基因测试多个sgRNA，以确定有效的sgRNA。
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