介绍
CRISPR-Cas9可用于编辑细胞以产生细胞池。这些细胞池中的细胞通常都是不一样的,比如有的没有被编辑,而有的在目标位点产生了不同的突变等。为了得到具有特定编辑或基因敲除的细胞系,研究人员需要对单个细胞进行克隆扩增。在本手册中我们将详细讲解如何从细胞池中分离单个细胞,然后进行扩增和确定基因型。
从基因敲除的细胞池中分离单个细胞可以通过有限稀释法完成。尽管有一些其他的方法也可以完成单细胞的分离,但是有限稀释法是可以通过最基础的移液枪等工具完成的。它的最大缺点在于其是基于统计概率来在每个孔中得到单细胞的,因此结果不是完全确定的。最常用于有限稀释法的浓度是每100μl的溶液中有0.5-1个细胞,因为这可以最大化每个孔中有单细胞的概率,同时最小化每个孔中有多个细胞的概率。在这一浓度下,约三分之一的孔中为单细胞,而大多数孔是空的。这种设计是因为在实验中排除掉没有细胞的孔远比找出哪些孔有多个细胞要容易得多。
在本手册中,来自被编辑的细胞池的细胞将被稀释至0.5-1个细胞每100μl,并被置于至少2个96孔板(100μl/孔)。如果是第一次克隆扩增的话我们建议可以为每个条件设置4个96孔板。
为了控制因编辑而带来的生长缺陷,我们建议可以使用空白对照或阴性对照,而对照并不需要多个96孔板。RELA(REL-associated protein)阳性对照并不需要置于96孔板中进行克隆扩增,因为它主要仅作为转染和编辑效率的阳性对照。
注意事项
克隆扩增的细胞系的发育情况与其细胞类型紧密相关。在进行单细胞的有限稀释之前,应当保证细胞处于健康的生长状态。对绝大多数细胞类型而言,在转染后等待六天通常足够让细胞稳定生长。如果使用冷冻细胞的话,在解冻后于37度和5%二氧化碳的情况下培养48小时,然后进行有限稀释(理想情况下细胞将传代一次)。根据细胞类型的不同,单细胞克隆扩增可能需要2-8周的时间。在扩增过程中应持续观察单细胞克隆的健康和生长状态。
需要注意的是细胞的基因被编辑不一定等同于基因敲除。不能被3整除的核苷酸的插入或删除(indel)会导致目标基因发生移码突变,由此产生的蛋白质很可能是无功能的。但一般而言,indel频率最高的细胞池能最有效地产生需要的敲除细胞系。
材料
1.5毫升微量离心管
10ml无菌试剂槽(Reagent reservoir)
多排移液枪(Multichannel pipette)
96孔细胞培养板
正常生长培养基
PBS
细胞解离试剂
细胞计数器
台盼蓝(Trypan Blue)
细胞过滤器(可选)
Protocol
有限稀释法(1天)
1. 在37℃的水浴中加热培养基。
2. 将含有转染细胞的24孔板从二氧化碳培养箱转移到生物安全柜。
3. 将不同条件培养下的细胞所在的液体培养基吸走。
4. 小心地用PBS洗细胞。
5. 吸走PBS。
6. 向细胞中加入250μl的TrypLE™(或其他合适的细胞分离试剂)(如果细胞已传代,则将TrypLE™的体积调整为细胞培养管的大小)。
7. 在37℃和5%的二氧化碳下培养细胞5分钟,或直到细胞分离。
8. 将培养板转移回生物安全柜。
9. 为了中和分离试剂,在每个孔中加入与TrypLE™等量的培养基(250μl)。
10. 用1毫升移液枪吹吸3-4次(如果需要的话可以更多)以打散细胞,也可以通过细胞过滤器来分离。
11. 将每个条件下的细胞转移到单独的无菌1.5毫升微量离心管中。
12. 用细胞计数器对每个条件下的细胞进行计数。
13. 计算细胞悬液中细胞的浓度(细胞/ml)。
14. 确定每个细胞池的96孔板的数量。建议为每个编辑过的细胞池设置一个或两个96孔板,以增加至少得到一个成功敲除的细胞克隆的可能性。
15. 将细胞稀释至0.5-1个细胞/100μl培养基的浓度(这一浓度将使得在96孔板的大多数孔中为1个细胞/孔)或在12 ml正常生长培养基中有120个细胞。根据所使用的96孔板数量确定总体积。例如,如果特定条件需要5 x 96孔板,则稀释至在60毫升正常生长培养基中有600个细胞。注:细胞浓度可根据实验调整(0.5-5细胞/100μl)。
16. 将稀释后的细胞悬液转移到一个大的无菌容器中。
17. 使用多排移液枪将100μl/孔稀释细胞悬液分配到每个孔。
18. 对将要进行扩增的每个编辑过的细胞克隆重复步骤13至17。
19. 将培养板转移到37℃ 5%二氧化碳的加湿培养箱中。
20. 扩增和确定基因型(如下)。
克隆扩增(2-8周)
用显微镜对已生成的单个菌落进行两周的筛选和观察。如果有克隆成像仪,我们建议在单细胞稀释2-4小时后(细胞分裂前)对96孔板中的每一孔板进行成像,之后在5-7天后应对细胞再次进行成像。这样能够跟踪细胞生长,并确认最后得到的克隆起源于单一的细胞。
对已经生成的克隆通过在孔盖上画圈或在表格中记录进行标记,注意不同的细胞可能生长速度不同。当克隆达到70%汇合度时,将它们转移至24孔板。在转移过程中,在每个克隆中挑选部分细胞以检测基因型(如下)。通过只扩增已确认编辑的克隆可以减少后期培养和筛选的工程量。同时,选取一些空白或阴性对照组的克隆用于之后与敲除细胞系对比。
基因分型
克隆可以分为野生型(未编辑)、包含纯合编辑或包含杂合编辑。当一对染色体的两个等位基因都有相同的突变时,表明是纯合编辑。这些菌落应该被保存下来并标记为潜在的基因敲除细胞。当一个等位基因有突变而另一个没有突变(野生型)时,或者当两个等位基因都有不同的突变(即复合杂合子)时,表示杂合子编辑。杂合子编辑可以很容易地通过色谱图中的重叠峰来识别,这些重叠峰位于gRNA所针对的区域的中心。由NHEJ途径修复的双链断裂常导致杂合编辑。在编辑超倍体细胞系时尤其如此。因为复合杂合子突变可能使基因失活,所以这些菌落也应该被标记为潜在的基因敲除细胞。
无论被编辑细胞是纯合子还是杂合子,建议选择含有导致移码突变的indel的克隆,最理想的是那些很早就产生终止密码子的克隆。保持原本的基因阅读框或仅改变外显子3'端少数氨基酸编码的Indels可能不会导致蛋白质功能丧失。
储存和附加分析
根据基因型识别出可能的基因敲除细胞后,这些细胞应该被分成两部分。一部分可以扩增用于超低温保存,另一部分可以通过Western Blot、ELISA、流式细胞仪或功能分析等方法来进一步验证基因敲除。