在现代生物医学研究中，Morpholino寡核苷酸凭借其独特的性质和强大功能，成为一种改变游戏规则的工具。这些分子不仅在基础研究中发挥着重要作用，还为治疗多种疾病带来了全新的希望。本文将介绍Morpholino的结构、功能及其在研究和治疗中的应用。
Morpholino的结构与原理
Morpholino寡核苷酸是一种先进的工具，用于阻断RNA位点，从而抑制细胞过程。Morpholino寡核苷酸通过特异性结合到其选定的靶位点，阻止细胞成分对该靶位点的访问。这一特性可用于阻断翻译、剪接、miRNA或其靶点的功能以及核酶活性。
Morpholino寡核苷酸的结构与天然核酸完全不同，其亚甲基吗啉环取代了核糖或脱氧核糖的糖基，非离子磷酰二酰胺键取代了DNA和RNA中的阴离子磷酸酯。每个吗啉环适当地定位一个标准DNA碱基（A、C、G、T）用于配对，使25碱基的Morpholino寡核苷酸能够通过Watson-Crick配对牢固而特异性地结合到RNA链中的互补25碱基靶位点上。由于Morpholino寡核苷酸的无电荷骨架不被酶识别，它对核酸酶完全稳定。
在基因研究中的应用
翻译阻断：通过空间阻挡翻译起始复合物，Morpholino可以完全抑制许多靶序列的表达。现有蛋白质降解后，目标蛋白带在Western blot中消失。与许多反义类型（如siRNA、磷硫代酯）不同，Morpholino通常不会导致其RNA靶标的降解，而是阻断目标RNA的生物活性直到其自然降解，从而释放Morpholino。这意味着RT-PCR不适合测定Morpholino的翻译阻断效果。
剪接阻断：通过阻断剪接前mRNA中的相关位点，Morpholino可用于修改和控制正常的剪接事件。这一活动可以通过RT-PCR方便地测定，成功的剪接修改会在电泳凝胶上的RT-PCR产物带中显现出变化。产物带可能会转移到新的分子量位置，或因触发转录物的无义介导降解，野生型剪接带的强度会降低或消失。
关于Morpholino实验的一般建议
评估输送效果：与所有基因敲低试剂一样，Morpholino的有效输送至关重要。对于使用胚胎显微注射的实验，确认输送效果并不关键，但对于培养细胞实验，确认输送效果非常重要。可以使用荧光标记的Morpholino评估是否获得了良好的细胞质输送。我们推荐使用价格低廉的荧光素标记标准对照寡核苷酸来实现这一目的。
使用荧光Morpholino确认输送效果时，在培养基中使用10微摩尔浓度的Morpholino寡核苷酸。这是一个足够高的浓度，经过16小时后，荧光标记的Morpholino应该能够通过荧光显微镜在细胞质中可见。倒置荧光显微镜是观察培养板中细胞的最佳选择。观察活细胞（未固定的）使用具有最高数值孔径的干物镜，以收集细胞中尽可能多的光线。成功输送表现为细胞质中的弥散荧光。点状荧光通常表示寡核苷酸被困在内体中，因此忽略点状荧光斑点，寻找弥散的荧光。
溶解度与Morpholino：虽然Morpholino寡核苷酸比其他非离子结构类型（如PNA）溶解性更高，但某些高G含量（>30%）的Morpholino溶解度有限。此外，红色发射荧光素的结合有时会降低寡核苷酸的溶解度。溶解度随寡核苷酸序列变化而难以预测。以下建议有助于保持寡核苷酸活性，如果您的序列溶解性较差。
长期储存时，Morpholino储备溶液最好冻干储存。次优选择是在室温下溶液储存。制备浓度在1毫摩尔或以下的Morpholino储备溶液有助于避免溶解性问题。冻融循环或长期储存在4℃下可能导致沉淀或容器中寡核苷酸的结合，降低溶液活性；建议在密封容器中室温储存，并为了避免瓶密封不良导致的蒸发，将储备液存放在潮湿环境中，如湿箱（例如带有一杯水的钟罩）。注意保持寡核苷酸不干燥，因为干燥后的寡核苷酸可能很难甚至无法重新溶解（尽管冻干的寡核苷酸相对容易溶解）。将瓶子存放在暗盒中或用箔纸包裹是一个良好做法，因为荧光标记的寡核苷酸在光照下会光漂白。
溶液中的聚集会导致生物活性随时间降低，这在室温储存的溶液中可能发生。在某些情况下，这可以通过在65℃下加热5分钟逆转，或在大多数情况下通过高压灭菌（使用液体循环）。寡核苷酸非常耐热，可以承受多轮高压灭菌而不降解。高压灭菌通常可以恢复由于寡核苷酸聚集导致活性降低的储备液。
DNA、RNA和大多数基因敲低试剂在实验过程中通常存放在冰浴中，以尽量减少核酸酶的降解。由于Morpholino完全抗酶降解且水溶液在室温下化学稳定（多年），建议在实验过程中将Morpholino储备溶液保持在室温。将储备溶液冷藏在冰浴中可能会导致Morpholino沉淀。
赛百盛的定制Morpholinos合成服务
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特点
- 目标基因沉默：可以设计定制Morpholino以针对特定基因，因此您可以确信它们在研究中会有效。
- 改进的属性：可以修改定制Morpholino以改进其属性，如其稳定性或其跨越细胞膜的能力。这可以使它们在您的研究中更有效。
- 快速且简单的合成：可以快速且简单地合成自定义Morpholino，因此您可以快速获得所需的结果。
修饰
常见的3'端修饰
- 3’-Azide
- 3’-Sulfo-cyanine5
- 3’-Carboxyfluorescein
- 3’-Premium
- 3’-Primary Amine
- 3’-Cyclooctyne
- 3’-AF 488
- 3’-Cholesterol
- 3’-Pyridyldithio Modifcation
- 3’-Alkyne
- 3’-Dabcyl
- 3’-Biotin
- 3’-Lissamine
- 3’-Disulfide amide for sulfhydryl linkage
常见的5'端修饰
- 5’-Azide
- 5’-Cyclooctyne
- 5’-Primary Amine
- 5’-Premium
- 5’-Triethylene Glycol
- 5’-Alkyne
- 5’-Hydroxy
- 5’-Dabcyl
- 5’-Cholesterol
- 5’-Disulfide amide
服务
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