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寡核苷酸池（Oligo pools）应用指南

寡核苷酸池（Oligo pools）的引物设计和扩增我们可以提供一些通用的使用指南，但对于具体的实验，我们的指南只能作为一般性的指导原则，您需要根据实验条件调整具体的实验步骤。Oligo pools的使用指导原则主要包括以下几点：

• 将所有序列加上一套通用引物，并在使用前进行PCR扩增。PCR扩增可以达到纯化Oligo pools的效果，因为失败的引物序列（指5’端缺失的引物序列）不能进行扩增。
• 为了达到较高的退火温度我们建议使用高Tm值或较长的引物。一般而言，较高的退火温度可减少引物错配，增强扩增的特异性。
• PCR扩增时我们建议不要用常规的Taq酶，推荐使用热启动酶，常用的有Fusion，Q5，Pfu，Vent和Platinum Taq酶。对于酶的选择需要谨慎，有些酶在使用前需要检测。
• 由于不同用户的序列长度、引物设计和聚合酶体系不同，因此起始模板的使用量也不同。作为PCR模板，建议使用反应总体积的1/100、1/400、1/1600、1/6400和1/25600进行梯度试验。设定PCR循环数比如25个循环进行扩增，使用凝胶或者Bioanalyzer检测PCR产物的量。只要PCR产物量达到要求，则使用体积较少的模板量作为最终的模板使用量。
• 如果需要从产物中提取多组序列，则先使用巢式PCR扩增全部的序列然后使用内引物扩增各组序列。仅一轮PCR可能不会得到较好的结果。
• 去除引物的基本策略由Oligo pools下游应用的具体需要而定，例如平末端和粘性末端。
• 对于通常的克隆来说，用户可以在通用引物内部插入IIS型限制性内切酶能够识别的酶切位点，PCR扩增后再去除通用引物。这些限制性内切酶可以在识别位点附近进行酶切，保持可变序列的完整性。限制性酶切后，寡核苷酸序列即可插入载体。